Las aminas biógenas (ABs) son compuestos generados por la descarboxilación de su aminoácido precursor. Entre las ABs más importantes se encuentran la histamina, la tiramina, la cadaverina y la putrescina. Su ingesta a elevadas concentraciones por la población en general o su consumo a bajas concentraciones en personas sensibles puede suponer un problema importante para la salud pública. Es por ello que es necesario emplear métodos sensibles para la detección de estos metabolitos en alimentos. Los productos lácteos, y en especial los quesos madurados, son uno de los alimentos habitualmente más implicados en intoxicaciones por histamina, generada por microorganismos con actividad descarboxilasa, lo que alumbra la necesidad de identificar estos microorganismos.   

Los objetivos de esta Tesis Doctoral fueron evaluar la concentración de histamina en productos lácteos tras la puesta a punto de un método de análisis sensible de ABs; identificar los microorganismos responsables de la presencia de histamina en quesos comerciales; estudiar el patrón de distribución de la AB principal, la histamina, en diferentes áreas de quesos comerciales y evaluar su relación con la presencia de microorganismos productores y las características físicas y químicas y; ensayar posibles soluciones microbianas y enzimáticas que permitan reducir su acumulación en quesos de larga maduración. 

Inicialmente, se desarrolló un método para la determinación de cuatro ABs (histamina, tiramina, putrescina y cadaverina) en diferentes productos lácteos (leche, yogur y kéfir) basado en HPLC de fase reversa acoplado a un sistema de fluorescencia. Las ABs se extrajeron selectivamente mediante extracción en fase sólida (SPE) y posteriormente se derivatizaron con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo carbamato (AQC). Se obtuvo un método con una elevada sensibilidad, con límites de detección de entre 0,12 y 0,2 mg/L. Este método fue aplicado en 37 muestras de leche, 23 de yogur, y 14 de kéfir dónde se pudo comprobar la variabilidad de ABs entre las muestras. Si bien la mayoría de las muestras de leche no superaron el límite de detección (LD), la frecuencia de aparición y la concentración de estos compuestos aumentó en yogur y kéfir alcanzando valores de hasta 79 mg/kg de ABs totales en muestras de kéfir. 

Es conocido que los quesos madurados pueden contener cantidades elevadas de histamina. La microbiota presente en el queso es la responsable por la descarboxilación de su aminoácido precursor, la histidina, debido a la acción de la histidina descarboxilasa. Para conocer el origen de la histamina se llevó a cabo la identificación de los microorganismos responsables de su formación en quesos. En primer lugar, se analizó la concentración de histamina de 39 tipos diferentes de quesos comerciales, para después identificar los microorganismos responsables de su aparición. Como resultado, una tercera parte de los quesos analizados contenían más de 200 mg/kg de histamina y dos de ellos superaron los 500 mg/kg histamina. Se obtuvieron aislados microbianos de los cinco quesos con las concentraciones más altas de histamina y se analizó el material genético total de los quesos, con el fin de verificar la presencia del gen de la histidina descarboxilasa (hdc). Tras comprobar la presencia del gen hdc en dichas muestras, se amplificó la secuencia de nucleótidos del gen hdc, y se sometió a secuenciación Sanger. En cuatro de los cinco quesos seleccionados, se detectó al microorganismo Lentilactobacillus parabuchneri, principal productor de histamina, mientras que uno de ellos se identificó a Tetragenococcus halophilus, microorganismo que presenta el gen hdc ubicado en un plásmido inestable. 

Una vez conocidos los microorganismos productores de histamina en quesos comerciales, se evaluó la distribución de histamina en cuatro zonas distales de 12 cuñas diferentes (corteza periférica e interna y núcleo periférico e interior) de quesos duros de larga maduración, y se procedió a la identificación de los microorganismos que contenían el gen hdc mediante secuenciación Sanger. Se observó un patrón de distribución de histamina en las diferentes zonas acumulándose en el centro y disminuyendo en la corteza, sin embargo, no se pudo establecer una correlación entre la distribución de la histamina y la microbiota presente, ya que la distribución de los microorganismos era similar en todas las partes del queso. En cuanto a la relación entre el análisis de las propiedades físicas y químicas de las diferentes áreas y la concentración de histamina se observó que la histamina tendía a acumularse en los lugares más salados, más húmedos y menos oxidados de la cuña. 

Finalmente, se evaluaron medidas basadas en el uso de la enzima Diamino Oxidasa (DAO) y de microorganismos potencialmente degradadores de histamina (Lacticaseibacillus casei 4a y 18b, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CECT 4005 y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus CECT 7207, dos cultivos iniciadores comerciales de yogur (Abiasa y CHR Hansen), y Debaryomyces hansenii), para disminuir la acumulación en quesos de este metabolito tras 100 días de maduración. Se fabricaron un total de 8 lotes de queso de leche de vaca con los microorganismos mencionados anteriormente o DAO, todos ellos conteniendo L. parabuchneri DSM 5987 (excepto el lote de queso de control negativo), responsable de la producción natural de histamina en el queso. Se analizaron las propiedades fisicoquímicas y sensoriales (olor), así como la concentración de histamina a lo largo de 100 días de maduración del queso. Como resultado, todas las estrategias aplicadas redujeron significativamente la concentración de histamina. Se consiguió una reducción de más del 45% en las muestras con D. hansenii, del 43% en las muestras con L. casei, del 42% en las muestras con L. bulgaricus y S. thermophilus, y del 23% de disminución en las muestras con DAO al final del periodo de maduración. No se observaron cambios fisicoquímicos significativos (peso, pH, actividad del agua, color o textura) en los quesos como consecuencia de la adición de los cultivos microbianos añadidos o DAO. Sin embargo, la adición de microorganismos degradadores de histamina produjo quesos con un olor diferente al percibido en las muestras control, que no fue percibido como desagradable.

Como conclusión, cabe destacar la puesta a punto de un método sensible para la determinación de ABs en productos lácteos que permite detectar niveles bajos de estos metabolitos. Los microorganismos identificados como productores de histamina en quesos no proceden de los cultivos iniciadores empleados en su elaboración, sino que son microorganismos contaminantes. La concentración de histamina aumenta en las zonas interiores y disminuye en las zonas exteriores del queso lo que desvela la importancia de llevar a cabo una estrategia de muestreo cuando se pretende determinar la cantidad de histamina presente en un queso. La elaboración de quesos con bajos niveles de histamina se podría lograr mediante el empleo de técnicas sensibles para la determinación de este metabolito en productos lácteos que permitiera prevenir su entrada en el mercado, la utilización de leche libre de microorganismos productores de histamina, la limpieza y desinfección de los equipos para evitar la contaminación durante la obtención de la leche y su procesado en la industria láctea con microorganismos productores de histamina, o el uso de microorganismos degradadores o DAO que pudieran degradar la histamina a lo largo de la etapa de maduración del queso.